[转载]DNA序列和大规模DNA测序策略的探讨 @ 2/25/2013

测序技术
人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成,人类基因的 定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展,测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能 力的提高, 大大推进了大规模DNA测序的进程。

第一节 DNA测序的基本方法

一、Maxam-Gilbert的化学降解测序法

①先用限制性内切酶把DNA切成10~200bp 的测序材料,②用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5′末端上的磷酸,③在5′OH端标记32P,用多核苷酸磷酸激酶催化,④标记片段变性为单链,⑤化学试剂 在特定碱基位置降解单链DNA,产生一组长度不等的DNA片段,⑥经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读,待测DNA的全部核苷酸序列就可直接 读出。

二、Sanger的酶降解测序法(链终止法)

这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物(2′3′-双脱氧核苷三磷酸ddNTP)的特异性终止进行DNA测序。

第二节 DNA测序的策略

一、定向测序策略

定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序,然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。

二、随机测序战略

随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy),此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建立亚克隆文库,从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。

三、多路测序战略

多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略,是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读,快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的 基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上,再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆。

四、聚合酶链式反应(PCR)

反应程序包括三个步骤:(1)DNA双链加热(94℃)变性成单链;(2)加入两种DNA单链引物,分别与两条模板链退 火(55℃);(3)DNA聚合酶从两引物的3′端按模板要求合成新生DNA链(72℃)。重复操作,可使DNA快速扩增,20个循环后可使模板DN A扩增1万倍,30个循环后可使模板DNA含量放大100万倍,只需2个多小时的时间。

五、大规模DNA测序的趋势——自动化

DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前,DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克 隆群顺序排定等过程均已平行发展,自动化操作紧随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡,原始数据积累将不成问题,关键是把全基因的散测序组装 起来,以实现DNA测序的完整性。目前,在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。

1、 克隆筛选 从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。

2、模板制备  现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。特定用途的DNA分离仪也已采用。

3、 测序反应 由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性,所以,DNA 测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。

4、自动放射性自显影阅读机 近几年来,自动化放射性自显影阅读机纷纷上市,并不断向商业化及科研应用方向发展。

5、自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。

第三节 未来的测序技术

一、质谱法(mass spectrometry)
新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法 分析大片段DNA成为可能。其中四极离子捕获效果更好。Fourier转型质谱或飞行时间质谱可进行极为敏感的DNA测序。

二、杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH)

杂交测序法是一种创新性的DNA测序技术,主要是采用一系列n-mer长的所有可能的寡核苷酸与未知DNA靶序列进行杂交,记录下最适的杂交片段,然后组装便可获得未知片段的碱基序列。

三、单分子测序法(single-molecule seguencing)

单分子测序法是美国Los Alames国家实验室(LANL))发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成,使不 同的荧光素标记不同的碱基,然后,用两个激光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记的DN A分子,将其置于液流系统,从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸,通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸,再根据检测到 的信号顺序确DNA顺序。

四、原子探针显微镜测序法(atomic probe microscopy)

80年代发展的原子探针显微镜技术如扫描遂道显微镜(scanning tunneling micro scopes,STM)和原子力显微镜(atomicforce microscopes,ATM)使直接检测DNA分子结构成为可能。STM是由IBM Zurich研究所的科学家发明的用来直接观察单分子、单原子结构的技术,最近有人将其应用于阅读DNA序列。

五、超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE)

1990年,Swerdlow H首次采用HUGE技术进行DNA测序研究。该技术是在单一超薄凝胶平板上放入多道平行样品,在超高压电场作用下,通过HUGE检测系统进行测序。
发布于 2/25/2013 12:10:30 | 评论:0

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