HPV专题2——人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)(2) @ 1/12/2010

HPV相关
3. HPV型别和相关疾病

超过100种HPV型别被鉴定并用数字指代,16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68为高危型性传播HPVs,可能导致宫颈上皮内瘤(CIN),外阴上皮内新生物(VIN),阴茎上皮内瘤(PIN),肛门上皮内瘤(AIN)的发生。
Disease    HPV type
Common warts (普通疣)    2, 7
Plantar warts (足底疣)
1, 2, 4, 63
Flat warts (平疣)
3, 10
Anogenital warts (肛门疣)
6, 11, 42, 44 and others[24]

Genital cancers (生殖器癌)
Highest risk [24]: 16, 18, 31, 45
Other high-risk[24][25]: 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59
Probably high-risk[25]: 26, 53, 66, 68, 73, 82

Epidermodysplasia verruciformis
(疣状表皮发育不良)    more than 15 types
Focal epithelial hyperplasia (oral)
(局灶性上皮增生)    13, 32
Oral papillomas(口腔疣)
6, 7, 11, 16, 32
3.1 癌症
HPV-induced cancers





有一打以上的HPV型别被称为“高危”型,因其能导致宫颈癌、肛门癌、阴道癌、阴茎癌、肺癌等。几种型别,特别是16型,被发现同口咽鳞状上皮细胞癌(一种头颈癌)相关。HPV诱发的癌症经常有病毒序列整合进细胞DNA。一些HPV早期基因,如E6和E7,已知作为癌基因促进肿瘤生长和恶性转化。口腔HPV感染增加口咽癌发病风险,和烟草及酒精无关。
E6和E7蛋白通过作抑制肿瘤阻遏基因p53和RB通路发挥作用。E6抑制p53,E7抑制p53,p21和RB。P53蛋白阻碍细胞生长,在DNA损伤时激发细胞编程性死亡。E6和用于降解蛋白的泛素化通路中的E6-AP蛋白关系密切。E6-AP连接泛素至p53蛋白,打上蛋白降解标签。

Genome organization of human papillomavirus type 16, one of the subtypes known to cause cervical cancer. (E1-E7 early genes, L1-L2 late genes: capsid)
一种或多种高危HPV型别的感染被认为是宫颈癌发生的必要前提。然而大部分的HPV感染被免疫系统快速的清除掉。因为普通宫颈细胞转化为癌细胞的进程很慢,所以癌症发生在长期感染HPV的人身上,通常有十几年或更长时间的持续感染期。
性传播HPVs同时引发大部分的肛门癌和约25%的鼻咽癌。后者通常出现在扁桃体区,HPV和非吸烟者的咽癌发病升高相关。与HPV感染者肛交或口交会增加这些种类癌症的发病。
有研究显示HPV感染和阴茎及肛门癌相关,且男性中的同性和双性性交者比异性性交者发病率高17-31%,并建议检测肛门癌的肛门巴氏涂片筛查应惠及进行肛交的亚群体。
3.2 疣
3.2.1 皮肤疣
一些HPV型别感染导致皮肤外层细胞快速生长,形成疣。包括:
普通疣:表皮(cutaneous)HPV,如HPV-1、2诱发,通常位于手、脚,也有发生于肘或膝盖处。特点为菜花样表面,略隆起于周围皮肤。表皮HPV型别能引发生殖器疣,但不诱发癌症。
平疣:常见于手臂、脸、或额头,儿童和青少年易生,免疫功能正常人群中平疣和癌症发生无关。
3.2.2 生殖器疣
生殖器和肛门疣(尖锐湿疣和性病疣)是生殖HPV感染最明显的标记。多种HPV型别都可导致生殖器疣,但HPV-6和11致病占到病例的90%。
大多数感染生殖HPVs的人在产生疣或其它症状前就已清除掉体内病毒。但即使未表现出症状的人依然传播病毒。引发生殖器疣的HPV和引发癌症的型别不同,但是个体可同时被多种HPV感染,所以疣的存在并不能排除高危型病毒存在的可能性。因为致病的型别不同,不会因为接触身体其它部位的普通疣而感染生殖疣。
3.2.3 呼吸道瘤
HPV-6和11可以引发一种少见的再发性呼吸道瘤,即疣在喉部或其它呼吸道区域反复发作,导致呼吸障碍,需反复手术治疗,在极少病例中发展为癌。
3.3 免疫损伤病人HPV感染
HPV在大部分免疫损伤病例中引发疣状表皮发育不良。免疫系统未检测到的病毒使皮肤细胞角蛋白过量表达导致疣状损伤或皮角(cutaneous horns)。(It’s terrible, you can search the word in google images.)
4. 感染预防
避孕套可以对生殖感染提供防护,但是任何爆露的皮肤都会传播病毒。
4.1 HPV疫苗
两种疫苗被应用于预防部分HPV型别感染,Gardasil,Merk推广,Cervarix由GlaxoSmithKline推广。两种疫苗都能抑制HPV-16、18(HPV相关癌症病例大部分由其引起)的初始感染。Gardasil也预防引发90%生殖疣的HPV-6、11型。
疫苗对已感染HPV-16、18的女性提供的保护非常有限。因此,疫苗被推荐最先用于还没有因性活动暴露给HPV的女性青少年。WHO关于HPV疫苗的意见书清晰列出用于政府HPV疫苗计划的适当的、符合成本效益的工作策略。
男性和女性都会携带HPV,男性接种疫苗的好处和效力正在被研究。HPV疫苗首席研究员Diane Harper 博士声明,Gardasil和Cervarix对降低美国宫本已很低的颈癌发病率的作用很小,但是对发展中国家却不一定。她也表示,还对15岁以下的儿童的有效实验还没有被施行。
4.2 女性宫颈和生殖道感染
因为女性宫颈和生殖道感染特殊型别HPV和宫颈癌发生高度相关,所以这些HPV型别被科研工作密切关注。这些部位的HPV感染主要经由性活动传播。至少有40种HPV型别感染生殖道。如果一个成年女性学生4年中每年至少一个伴侣的话,她离开学校时带有HPV感染的可能性大于85%。避孕套无法阻止病毒因为生殖区周围区域还包括为被覆盖的大腿内侧,这些区域被暴露给感染个体的皮肤。
4.2.1 避孕套
疾控中心说男性“使用避孕套可以降低生殖HPV感染的风险”,但是同其它性传播疾病相比提供的保护程度较低,“因为HPV也可因暴露于未被避孕套覆盖或保护的区域而感染(如,感染的皮肤或粘膜)。”
研究证明规律性使用避孕套能有效的限制已感染个体的持续感染和HPV感染新的生殖部位。因此,避孕套的使用降低已感染个体向宫颈癌和生殖疣发展的风险。计划生育(Planned Parenthood)推荐使用避孕套减少接触HPV。
4.2.2 公共物品接触
应避免共用可能被污染的物体,尽管有可能,但对女性生殖HPV感染来说,除性交以外的传播途径并不常见。
4.3 口腔感染
口腔HPV感染和HPV阳性口咽癌相关。口腔HPV感染机率同现代伴侣的口交和张口接吻数目增加而增加。
发布于 1/12/2010 14:16:39 | 评论:0

HPV专题2——人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)(1) @ 1/12/2010

HPV相关
HPV是乳头瘤病毒的一种,感染人类表皮和粘膜。HPV可以导致女性宫颈、阴道、阴户和肛门处癌症。男性肛门和阴茎处癌症。鉴定出的HPV型别约有130种。一些型别引发疣,一些型别导致癌症,还有一些没有特别的症状,无害。大部分感染HPV的人不知道他们被感染了。
约有30-40种型别的HPV典型性的通过性接触传播感染肛门生殖区。一些性传播HPV型引发生殖器疣。持续感染高危型HPV可能促发癌前期病变和癌症病变。几乎所有宫颈癌病例都是由HPV感染引起,但是大部分HPV型别的感染不会致病。
大部分年轻女性的HPV感染是暂时的,没有显著长期性。70%的感染在一年内消失,90%两年消失,但是当持续感染时,5-10%的感染妇女有发展为宫颈癌前期(宫颈损伤)的高危风险,最终可能发展为宫颈癌。发展的过程可能持续15-20年,为癌前期的检测和治疗提供了大量机会,通常有很高的治愈率。
在美国和其它资源丰富国家,巴氏检测(Pap)用于检测可能发展为癌细胞的异常细胞。宫颈检查同时可以查出疣和其它异常生长物(目检)。异生物和似癌区可以通过简单方法移除,如灼烧环或发展中地区普遍使用的冷冻疗法。HPV DNA检测比Pap或目检更灵敏,是一项低成本HPV检测方法,适用于低资源配制的地区,使得高灵敏度的HPV筛查在非洲、亚洲和拉丁美洲等地区可以施行。
Pap涂片技术在发达国家降低了宫颈癌的患病率和死亡率,但即使如此,2008年美国仍有11,000例发病其中3,900例死亡。宫颈癌在低资源配制地区死亡率居高,世界范围有490,000例发病,270,000例死亡。80-85%的死亡发生在低资源配制的发展中国家。
HPV疫苗,Gardasil和Cervarix将进一步降低发病,它们可以预防导致70%宫颈癌的HPV 16和18型感染。
1.    患病率
1.1美国
HPV在美国被评为最普遍的性传播感染。大部分有性活动的男女都会在生活中的几个时期感染生殖HPV。ASHA(American Social Health Association,美国社会卫生协会)报告评估约75-80%的有性生活的美国人在一生中的几个时期感染HPV。80%的妇女到50岁时至少接触过一次生殖HPV。据资料估计,2000年时15-44岁的美国人中有将近620万新增感染,74%发生在15-24岁人群中。STDs研究发现生殖HPV最容易获得。
HPV患病率评估在14%-90%波动。一个原因是一些研究报告当前可检测感染,而另一些研究则报道曾经被感染。另一个导致偏差的原因检测型别的不同。
有研究发现2003-2004年期间的任何一个时候,14-59岁妇女中都有26.8%至少感染一种型别的HPV,高于以前的统计。15.2%感染一种或多种可能导致癌症的高危型别。但是只有3.4%感染Gardasil疫苗预防的4中型别,远低于以前的判断。
各年龄段HPV感染率
Age        Prevalence
14-29    24.5%
20-24    44.8%
25-29    27.4%
30-39    27.5%
40-49    25.2%
50-59    19.6%
14-59    26.8%
上表可以看出HPV感染率随年龄下降而下降,这可能是因为HPV感染被免疫系统清除,或者体内存活量低于检测水平。HPV在感染者体内可以存活的时间比较模糊——多数时间为潜伏期,不时引发症候和疾病。Albert Einstein医学院和Washington大学最近的研究成果都支持大部分人体内的HPV会被状态良好的免疫系统最终清除,而在一些体内存在尚未明确病毒的病例中,如果免疫系统衰弱就会表现出症状。
2. HPV生活周期
HPV的生活周期严格遵循宿主角化细胞的分化进程。推测HPV病毒体通过微创感染上皮组织,首先病毒体和假定的受体(如as alpha integrins 和 laminins)结合,然后根据HPV型别由笼形蛋白和/或小窝蛋白介导的内吞作用进入基底细胞层,病毒基因组被未明机制传送至细胞核,每细胞复制10-200拷贝稳固病毒自身基因组,而复杂的级联转录则在上层上皮细胞中的宿主角化细胞开始分离分化时启动。
2.1 E6/E7蛋白
病毒癌基因E6和E7被认为作用于修改细胞周期,将分化中的宿主角化细胞保持在适于病毒基因组复制和后续表达的状态。E6同联合宿主E6 AP蛋白(泛素连接酶活性)泛素化p53蛋白,使蛋白降解。E7(致癌HPV中)作为初始转化蛋白,与pRb竞争性结合,释放转录因子E2F,反式激活靶序列,推动细胞周期。所有的HPV都能够诱导短暂增殖,但是只有16和18 能够体外诱导永生化的整体缺陷型细胞。同时证明HPV16和18不能单独永生化原发鼠细胞,必须激活ras癌基因。晚期基因L1和L2在宿主上皮细胞上层转录/表达,作为结构蛋白壳体化扩增的病毒基因组。一旦基因组被包装,衣壳经依赖氧化还原反应过程组装/成熟。组装/成熟过程稳定病毒体并提高特异侵染性,此后病毒体从宿主死亡的上皮组织中脱落继续下一个循环周期。
2.2 潜伏期
当HPV病毒侵入细胞后,感染立即发生,病毒被传送。SIL(鳞状上皮损伤)可能在感染后几个月至几年时间发生并被临床检测到。从有效感染到临床可检测疾病的间隔期使确定感染来源有一定的难度。
发布于 1/12/2010 14:15:22 | 评论:0

单酶切定向克隆 @ 1/11/2010

实验台
原理:利用限制性内切酶Bgl I GCCNNNN/NGGC,Sfi I GGCCNNNN/NGGCC等的特点,在N处引入不同序列达成单酶切定向的目的
步骤:
1. 改造载体,引入上诉酶的酶切位点
2. 靶序列两侧加同酶切位点不同序列的接头
3. 载体、靶序列 酶切,纯化
4. 连接、克隆
5. 抗生素抗性、PCR、杂交等方法筛选阳性序列
6. 测序确定靶序列无突变

注:适用于多个目的序列插入同一载体,要求定向的反复操作。如制备核酸检测试剂时的质控品,用病毒或噬菌体蛋白包裹DNA或RNA,做成假病毒防止降解;制备大批量靶序列的腺病毒、慢病毒载体等
发布于 1/11/2010 16:34:19 | 评论:1

多序列下载 @ 1/11/2010

数据相关
核酸序列
NCBI——Nucleotide——输入序列的ACCESSION,以空格间隔——“search”——在Display中选择需要的格式,如Genbank或FASTA——在Show中选择File——保存就可以了。
结果将被保存入一个文件,很合适去做Alignment;如果用Edit打开则显示为多个文件,或将原文件拆分为多个文件直接存入当前文件夹。文件信息栏中显示的内容则根据display中选择的格式不同而有不同。
发布于 1/11/2010 15:57:31 | 评论:0

HPV专题1——乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)(2) @ 12/4/2009

HPV相关
1. 乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)
。。。
1.5    组织特异性
PVs只在角质细胞内复制。 角质细胞构成皮肤的最外层,和脸颊的内侧,阴道壁等粘膜表面一样。这些表面复层鳞状上皮组织由扁平细胞层叠构成。细胞层借助细胞分化形成,在这个过程中角质细胞逐渐专一化,最终形成硬质交联表面,防止水分散失并构成阻挡病原体的屏障。充满表层的未分化角质干细胞被认为是PV初始感染靶标,而后续病毒生活周期中每一步都严格遵从角质细胞分化过程。从而导致PVs只能在体表组织中复制。
1.6    生活周期
(1)感染路径        PVs通过皮肤或粘膜表面的微小创口进入角质细胞,L1和细胞表面的硫酸化糖基作用促进病毒粘附。然后病毒与特异受体(可能是alpha-6 beta-4 integrin)作用,形成内含体,进入细胞内部。壳蛋白L2破坏内含体膜,病毒基因组被释放,同L2一起转移至细胞核。
(2)持续感染        成功感染角质细胞后,病毒表达E1,E2蛋白,用于病毒DNA的循环复制和维护。病毒原癌基因E6、E7钝化肿瘤抑制蛋白p53和pRb,加速细胞生长。PV可以持续感染基质层角质干细胞数十年。
(3)子代病毒产生    病毒晚期基因L和L2的表达严格受限于宿主角质细胞分化。L1和L2表达量增加和病毒基因组拷贝数迅速增长相关。因为复层扁平上皮细胞的外层受到免疫系统相对有限的监护,所以病毒晚期基因的受限表达被认为是一种免疫逃避方式。新的感染性子代病毒在细胞核内组装,PVs已经进化出向环境释放病毒颗粒的机制。其它无被膜动物病毒使用高效的溶解方式杀死宿主细胞,释放子代病毒颗粒。通常这种溶解过程伴随炎症反应,触发免疫攻击抵抗病毒。而PVs开发出隐秘的,非炎性的工作机制,利用脱皮释放病毒颗粒。
(4)癌症        尽管一些型别的PV会导致所在上皮组织癌变,但癌症并非典型的感染结果。PV引发的癌症的进程一般都跨越很多年。
1.7    实验室研究
PV生活周期严格遵从角质细胞分化,无法使用常规细胞系培养PVs,为实验室研究PVs设下了障碍。因为可以从病毒感染的牛的巨大疣状物中提取感染性BPV-1病毒颗粒,所以多年中将其用作家畜模型。CRPV,ROPV(兔口腔PV)和COPV(狗口腔PV)也被广泛用于实验室研究。
一些性传播HPV型别通过将HPV感染的人细胞植入免疫缺陷小鼠的方式用小鼠异种移植系统进行繁殖。一些团队成功的从宫颈病变中分离感染性HPV-16。但是这种技术分离感染性病毒既费力产量又低。
角质细胞的分化可以通过将培养的角质细胞暴露于气/液界面进行体外模仿。如此“raft culture”系统用于于PVs研究是病毒生活周期体外研究的重大突破。当然,这种大量培养系统(raft culture system)比较麻烦,感染性PVs的产量也较低。
可以稳定复制HPV基因的酵母培养系统的发展,提供了一种便利、快速、廉价的研究HPV生活周期的方法。例如,E2-依赖性转录,基因组扩增,全长HPV DNAs有效壳体化都可以在酵母中简单重现。
目前,发展出短期高产量生产携带报告基因的HPV假病毒的方法,尽管假病毒并不适用于病毒生活周期部分方面的研究,但是最初的研究成果支持假病毒的结构和初始感染细胞途径和真实PVs在许多方面都大致相似。
1.8    遗传构成
PV基因组被分为早期区(E),编码基因在病毒感染宿主细胞后立即表达;晚期区(L),编码衣壳蛋白基因L1和L2。所有的基因编码在一条DNA链上。PVs和多瘤病毒在这点上表现出明显的差别,后者的两条DNA链双向转录表达早期和晚期基因。尽管PVs和多瘤病毒在病毒颗粒结构上表现出惊人的相似,但它们可能从未拥有同一祖先,DNA结构的差异是决定性的因素。
1.9    基因功能
PV基因组内基因通常在和其它已鉴定基因相似性比较后被鉴定。当然只是通过基因组定位会将一些假开放阅读框误认为基因,特别是E3、E4、E5和E8开放阅读框。
E1        编码病毒基因组长控制区复制起始区结合蛋白。E1水解ATP,表现解螺旋酶活性,帮助DNA解链,在细胞DNA复制因子作用下参与病毒基因组复制准备。
E2        E2蛋白是位于长控制区病毒启动子的主要转录调控因子。E2蛋白有一个激活区被不明结构的铰链连接至特征明显的DNA结合区。E2促进E1结合至病毒的复制起始区,同时也利用细胞蛋白Brd4连接病毒基因组和细胞染色体。与细胞核基质相连能保证在细胞分化时将病毒基因组忠实分配到子代细胞。E2被认为是潜伏的HPV感染基底层角化细胞原癌基因E6、E7表达的负调控因子。遗传变异,例如病毒DNA整合入宿主染色体,钝化E2表达,原癌基因E6、E7表达增加,导致细胞转化和遗传稳定性降低。
E3        这个小的有争议的基因只存在于少数PV型别中,还未发现其表达蛋白和表现出任何活性。
E4        E4蛋白在病毒感染早期表达水平低,感染晚期迅速的增加。在HPV-1的例子中,E4构成疣表面总蛋白的30%。多种PV型别的E4蛋白被认为通过破坏角化细胞骨架中间丝促进病毒颗粒向环境释放。不能表达E4的病毒突变体无法高水平复制病毒DNA,但是E4如何促进DNA复制的机制还不清楚。E4还被证明参与捕获G2期细胞。
E5        E5是小的疏水性蛋白,破坏感染细胞内的许多膜蛋白的功能。一些动物PV型别的E5蛋白(主要是BPV-1)为原癌基因,主要通过激活血小板衍生生长因子受体的细胞生长促进信号。HPV E5蛋白同癌症相关,作用似乎是激活表皮生长因子介导的级联信号。HPV16 和HPV2 的E5蛋白也表现出下行调节表面表达主要组织相容性复合物1类蛋白,这类蛋白可以阻止感染细胞被T细胞清除。
E6        E6的主要功能是钝化肿瘤抑制蛋白p53,同时和大量细胞蛋白相互作用是研究关注焦点。HPV引发癌症的恶性表型严格依赖E6表达,是治疗性HPV疫苗的目标靶标。
E7        多数PV型别中,E7的主要功能是钝化肿瘤抑制蛋白pRb家族成员。E6,E7共同作用于阻止细胞程序性死亡和加速细胞周期,启动细胞复制病毒DNA。同时E7通过激活细胞端粒酶参与感染细胞的永生化。和E6相同,E7也是研究的重点项目,相信在感染细胞中发挥出大量的其它功能。E6和E7的持续表达是癌细胞株存活的必需条件,如从HPV感染肿瘤中获得的HeLa细胞系。
E8        只有少数PV型的E8基因编码蛋白,例如在BPV-4中,E8开放阅读框可以替代这一PV病毒种中不存在的E6开放阅读框。这些E8基因在化学和功能上与HPVs E5基因相似,也被称为E5/E8。
L1        L1自组装为五聚体病毒壳微体,纯化的微体进一步形成衣壳,相邻L1分子由二硫键连接。L1衣壳体外组装是预防HPV性疫苗的基础。和其它 PV基因相比,L1的大部分氨基酸序列型别间保守,L1的表面环却有本质上的差别,甚至是某一特定PV种属中的不同成员也存在差别。这可能是逃避先前PV感染引发的中和抗体反应的表现。
L2        除了和L1合作将病毒DNA打包成病毒颗粒外,L2也和感染进程中的细胞蛋白相互作用。病毒体和细胞连接后,L2 被胞内蛋白酶furin切掉。病毒体内陷形成内含体可能由网格蛋白介导,内含体中的酸性环境被认为可能导致破坏膜稳定性的L2暴露。胞内蛋白beta-actin和suntaxin-18也许也参与L2 介导的通路。经内含体运送,L2和病毒基因组被输入细胞核的亚区,转录因子中丰富存在的ND-10。L2的小部分区域在不同的PV型别中非常保守,以这些保守区为靶标的实验性疫苗可以提供对部分HPV型别进行防御。
发布于 12/4/2009 14:21:28 | 评论:1

Entrez @ 11/20/2009

工具
Entre是我们这行最常用的搜索工具了,可是今天看了一下,好多数据库都没有用过哦!
Entrez Global Query Cross-Database Search System是一个强大的联合搜索引擎,或者说是可以让使用者在NCBI网点中查询很多健康科学数据库的网络入口。NCBI隶属NLM(国立医学图书馆),而NLM是美国NIH(国立卫生研究院)下属部门。
Entrez 检索下列数据库:
•    PubMed: 生物医学文献引文和摘要,包括Medline(主要为医学杂志文章),提供1990s后文章的Pubmed Central 和其它全文资源链接。
•    PubMed Central: 免费全文生物医学和生命科学文章数据库
•    Site Search: NCBI web and FTP web sites
•    Books: online books
•    OMIM: 在线人类孟德尔遗传,对已知遗传疾病编目,并提供可能的相关基因。
•    OMIA: 在线动物孟德尔遗传
•    Nucleotide: sequence database (GenBank)
•    Protein: sequence database
•    Genome: 全基因组序列和基因图
•    Structure: 三维大分子结构
•    Taxonomy: GenBank生物分类
•    SNP: 单核苷酸多态性
•    Gene: gene-centered information
•    HomoloGene: eukaryotic homology groups
•    PubChem Compound: unique small molecule chemical structures
•    PubChem Substance: deposited chemical substance records
•    Genome Project: genome project information
•    UniGene: gene-oriented clusters of transcript sequences
•    CDD: conserved protein domain database
•    3D Domains: domains from Entrez Structure
•    UniSTS: markers and mapping data
•    PopSet: population study data sets (epidemiology)
•    GEO Profiles: expression and molecular abundance profiles
•    GEO DataSets: experimental sets of GEO data
•    Cancer Chromosomes: cytogenetic databases
•    PubChem BioAssay: bioactivity screens of chemical substances
•    GENSAT: gene expression atlas of mouse central nervous system
•    Probe: sequence-specific reagents
•    NLM Catalog: NLM bibliographic data for over 1.2 million journals, books, audiovisuals, computer software, electronic resources, and other materials resident in LocatorPlus (updated every weekday).
发布于 11/20/2009 16:28:25 | 评论:1

HPV专题1——乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)(1) @ 11/17/2009

HPV相关
1. 乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)
乳头瘤病毒科,无被膜DNA病毒,古老而多变的病毒家族,下面划分了几百个病毒种,通常我们称之为“型(type)”,在所有被检测的动物中都有发现其感染,除了少数爬行动物,特别是龟类。大部分型别乳头瘤病毒的感染无症状或导致良性肿瘤,例如乳头状瘤或疣。而另外一些型别,例如人乳头瘤病毒16型、18型等则会带来癌症发病风险。
乳头瘤病毒有高度的宿主和组织倾向性,物种间传递非常罕见。病毒在体表组织基底层复制,复制具有排外性。所有已知型别的乳头瘤病毒感染特殊体表部位,典型性的有皮肤或生殖器、肛门、口、呼吸道的粘膜上皮。例如人乳头瘤病毒1型感染导致足底疣,2型掌心疣。
    乳头瘤病毒在20世纪被鉴定,当时发现皮肤疣或乳头瘤可以通过滤过性病原体在个体间传染。1935年先前曾证明鸡中存在导致癌症的肉瘤病毒的Francis Peyton Rous又证明乳头瘤病毒导致了被感染兔子的皮肤癌。这是首次证实病毒可能使动物致癌。
1.1    分类学
乳头瘤病毒(PVs)有相似的基因组构成,任何PVs配对都有至少50%同源基因,尽管核酸序列歧化超过50%。同源比对系统学算法可以建立不依赖基因分析的有相似拓扑性的系统树。系统学研究有力的证明PVs和其哺乳动物和禽类宿主共同进化,没有改变宿主类型,没有重组,在1亿年历史中维持着基本的基因组构成。这些序列比较构成PV分类的基础,并已被国际病毒分类委员会认可。所有PVs构成乳头瘤病毒科,乳头瘤病毒科代替乳多空病毒科,从多瘤病毒科中独立。PVs系统树中的主要分支用希腊字母命名为属,次要分支为种和PV型,种(型)之间只是基因组上的距离,不存在已知的生物学差异。新的分类系统不影响传统鉴定及PV型和它们基因差异很小的独立群的特征,意指“种”以下的分类水平,“亚型”和“突变体”。
1.2    动物乳头瘤病毒
个别乳头瘤病毒型倾向在单一动物物种中高度复制。有研究者在实验中取了动物园中多种动物的前额皮肤拭子,用PCR扩增PV DNA。尽管实验中发现了很多种PV序列,但作者没有发现种间传播的证据。有趣的是,一个动物园管理员检测结果在一段较短时间内保持阳性,但其PCR结果为一种黑猩猩特异的PV 序列。最后作者表示可能是皮肤表面污染而非有效感染。
白尾棕色兔乳头瘤病毒(CRPV)能在自然宿主北美Sylvilagus兔中引发突出的瘤。这种角状瘤有可能就是传说中美洲双角兔“Jackalope”和欧洲“Wolpertinger”的原型。欧洲家兔(genus Orytolagus)可在实验室条件下被CRPV短暂感染,但不产生感染性的子代病毒,被看做是CRPV的偶然或终结宿主。
中间传播在牛乳头瘤病毒(BPV)1型中也有记载。BPV-1诱导自然宿主(牛)巨纤维皮肤瘤。偶然宿主马感染BPV-1则导致良性瘤——结节病(sarciods)。BPV-1在农业上的重要意义促使抗病毒疫苗的成功制造。
一些报导在小的啮齿动物中鉴定出PVs,例如叙利亚鼠、非洲多乳头鼠和欧洲田鼠。但是没有没有已知的可以感染实验小鼠的乳头瘤病毒。缺乏可控的PV感染小鼠模型是PVs实验室研究的主要限制。

1.3    进化
PVs的进化同其它病毒种类相比很慢,可能由于PV的基因组由遗传稳定的双链DNA构成,宿主的细胞的DNA复制机制会对其进行高保真复制。
PVs常年和特殊种类的宿主共同进化,一个特别快速的例子,HPV-16在人类扩散到全球过程中发生了轻度进化,现在在不同地理区有不同变化,这种不同可能反映了人类的迁徙史。
其他型别的HPV,如HPV-13在不同人群中变化相对很小。事实上,HPV-13序列非常接近倭黑猩猩(bonobos)。还不清楚,这种近似是由于新近发生的种间传播,还是因为HPV-13在人类和倭黑猩猩分化的这600万年左右只发生了很小的变化。
1.4    结构
PVs无被膜,即病毒外壳或衣壳无类脂膜。L1病毒蛋白是构成包括72个星形颗粒的60纳米衣壳的必要及充分条件。同多数无被膜病毒相同,衣壳表现为规则的20面体。成功的HPV疫苗中的一类就是以L1组成的自组装病毒类似颗粒为基础,设计引发病毒中和抗体,防止HPV初始感染。
PV基因组由约8000bp的环状双链DNA分子组成,细胞组蛋白帮助缠绕浓缩DNA,L1外壳包裹。
PV衣壳也包括低丰度的病毒蛋白L2,尽管还不清楚L2在病毒体中的位置,但L2已知有几项重要的功能,包括促进病毒基因组打包进入新生的病毒颗粒,及病毒对新的细胞宿主的感染。L2可能成为更广泛的保护性HPV疫苗的靶标。
1.5    组织特异性
1.6    生活周期
1.7    实验室研究
1.8    遗传构成
1.9    基因功能




发布于 11/17/2009 10:30:20 | 评论:2

MALDI-TOF MS核酸检测方法——claire20091116 @ 11/17/2009

每一天
MALDI-TOF MS核酸检测方法
随着人类基因组计划在2003年提前完成,后基因组计划的蓬勃发展,新技术不断涌现,更多的研究成果和新技术和仪器被应用于学科深层领域的研究和医学临床检测。精细定量,精确定位,大规模高通量,自动化,人性化的研究工具和操作系统受到广大科研工作者和临床检测人员的推崇和好评。核酸质谱技术结合了质谱技术的高灵敏、精确性,PCR的高敏感性和阵列技术的高通量,近几年在核酸的定性定量研究和应用中取得非常多的成绩。这里我们将从工作原理,科研、临床应用等方面为大家介绍基质辅助激光激光解析电离时间飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)核酸检测方法。
1. 基质辅助激光激光解析电离时间飞行时间质谱 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) 工作原理
1986年Eugen Goldstein发现阴极射线和阳极射线;1899年Wilhelm Wien利用质量电荷比在电场和磁场分离阳极射线并发现质量电荷比同放电管中的气体属性相关,J.J. Thomson继Wien之后通过降低压力改良Wien的研究;1918年、1919年A. J. Dempster和F. W. Aston分别设计并建造了质谱仪,帮助物理学家通过元素质量鉴定样品化合物成分和同位素组成,奠定了现代质谱仪的基本理论和设计概念。1989年,Hans Dehmelt 和 Wolfgang Paul 因五六十年代发明了离子收集技术或诺贝尔物理奖;2002年,J. B.  Fenn和K. Tanaka因在1987年分别发明电喷射离子化(electrospray ionization, ESI)和软激光解析(soft laser desorption, SLD)技术共同获得诺贝尔化学奖;而MALDI技术由Franz Hillenkamp和Michael Karas发明,并被广泛用于蛋白分析[1]。
1.1 质谱(Mass spectrometry, MS)技术原理
MS技术主要用于测定样品或分子的元素组成和分子化学结构,例如肽和其它化合物。原理主要是化合物离子化产生带电分子或分子片段,带点颗粒加速经过电磁场,被检测并根据其质量电荷比值[2]分类。质谱仪由3个模块构成:(1)离子源,用于样品气化、离子化。 离子化技术包括电子电离和化学电离。EI (electrospray ionization)和MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)这两项技术常被用于生物液体和固体样本离子化。(2)质量分析器,提供电磁场通过质量电荷比值(m/z)分离离子。质量分析方法主要有:Sector,Time-of-flight (TOF),Quadrupole,Quadrupole ion trap,Linear quadrupole ion trap,Fourier transform ion cyclotron resonace,Orbitrap和其它一些为特殊情况设计的质量分析器[3-9]。(3)检测器,记录离子经过或轰击表面产生的电荷或电流,计算离子丰度,检测器信号或经过增幅的信号经过扫描绘制成质谱。质谱技术可用于定量和定性检测。
1.2 基质辅助激光激光解析电离(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization,MALDI)
MALDI是一项弱离子化技术,用于生物分子(如蛋白、肽、糖)和大有机分子(如聚合物)等在常规离子化条件下脆性过大分子的质谱分析,和电喷射离子化性质相似。离子化作用由激光触发,使用基质保护生物分子免受激光直接损伤,并帮助分子气化、离子化。EI和MALDI是核酸质谱分析常用的弱离子化技术[10,11]。
基质包括3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid、2,5-dihydroxybenzoic acid、3-hydroxypicolinic acid、α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid methyl ester)等添加TFA的水、有机溶剂混合液,合适的基质在满足基本条件后通过反复试验获得[12-16]。分析物的基质溶液点入MALDI板,溶剂挥发后,基质再和分析物再结晶,晶斑经激光照射获得能量离子化,转移部分电荷到分析物,使分析物离子化并降低激光的能量破坏。此时分析物构成由中性分子[M]和增加(如[M+H]+)、减少(如[M-H]-)的类分子离子。MALDI能够产生单电荷离子,但同时也会产生多电荷离子。
1.3 飞行时间质谱 (Time-of-flight MS, TOF MS)
TOFMS中用给定强度电场加速离子,使带相同电荷的离子动能相同,离子速度仅依赖于质量电荷的比值,测量带颗粒到达固定长度距离检测器的时间,飞行时间同质量电荷比值相关,质量小的颗粒先到达。根据测得的时间和已知的实验参数可以得出离子的质量电荷比。TOF MS中常使用下列技术提高离子分辨率,Delayed extraction, Reflectron TOF, Ion gating, Orthogonal acceleration TOF, Hadamard transform TOF, Tandem TOF/TOF[17-19]。
TOF MS 由于质量范围大而广泛的和MALDI联合使用,TOF测量步骤也因为脉冲激光独立发射而非连续操作而非常适用于MALDI离子化过程。MALDI-TOF质谱仪典型性的安装有“离子镜”,在电场中偏转离子,加倍离子飞行距离增加分辨率。现在商业化偏转 TOF设备的分辨率m/Δm 约为20’000FWHM(full-width half-maximum, Δm指50%峰高时的峰幅)。
2. MALDI-TOF MS核酸检测
MALDI-TOF MS分别在1995年和1998年作为核酸检测技术引入DNA[20]和RNA[21]分析。检测样品需被制成3-29bp(1,000-8,600 Dalton)的单链核酸,和基质混合。
1998年 Zhengdong Fei 等提出ddNTPs质量标记(引物单核苷酸延伸)方法制备质量样本使用MALDI-TOF MS 检测SNPs[22],2002年 Rodi等提出使用UDG酶介导的碱基特异性剪切引入PCR产物片段结合MALDI-TOF MS的方法[23]。2003年Krebs 等提出基于RNA体外转录PCR(T3和T7-tailed引物)、rGTP特异性识别的RNase T1介导的碱基特异性剪切和MALDI-TOF MS 结合检测SNPs[24]。Hartmer 等提出加入T7、SP6 RNA启动子,RNAse T1,阵列技术的高通量质谱检测SNPs方法[25]。Stanssens等使用RNAse A(特异性剪切C或T碱基)和样品DNA双向转录方法,同时对序列中所有的4个碱基特异性剪切[26],使结果更为准确。这种方法也被称为hMC-Assay,分别产生4个核苷酸的质量图谱。一般来说,T剪切反应比C剪切反应稳定[27]。同年Sebastian使用上诉双向转录,4碱基酶切方法检测100-1000bpPCR片段的SNPs和突变,并提出应用于未知和连续突变点的算法[28]。2005年,Mathias Ehrich等提出用MALDI-TOF MS结合碱基特异性剪切方法高通量鉴定甲基化位点,对一个或多个CpG位点半定量测定[29]。2008年Sun Pyo Hong 等使用TypeIIS限制性内切酶制备不同质量片段,构建限制性片段质量多态性(RFMP)质谱对HPV分型[30]。
样品不纯会严重影响分基质-析物纯的共结晶,进而影响质谱结果;另一方面,核酸磷酸股价带有负电荷和反应缓冲液中的Na+、K+作用严重影响质谱信号的强度和分辨率,所以必须对样品进行有效的纯化。液相色谱纯化耗时太长,成本太高;常用的乙醇沉淀、透析、凝胶过滤等方法,或是加入阳离子交换树脂替换碱性离子的方法无法有效去除反应缓冲液中的去污剂。2006年Sauer等提出化学修饰的方法使用磷酸酰基团替换磷酸基团,甲硫化产生带有一个正或负电荷的产物,然后依赖基质的解析,用于高通量候选基因SNP质谱分型中,也称为无需纯化检测(GOOD Assay)[31]。
MALDI-TOF MS可以分辨2-5da的质量差,单核苷酸改变产生9-40da的质量漂移,所以可以被MALDI-TOF MS轻易的检出。通常情况下hMC-MALDI-TOF MS可以检测500bp片段中98%的SNPs。实际上,因为质量图谱质量、片段质量超出检测范围或质量相同的几个片段造成沉默峰等原因,一些反应的结果无法判断。MALDI-TOF MS 核酸检测具有PCR技术的高敏感性,模板浓度要求低、质谱技术的高分辨率和阵列技术的高通量等特点,且无需化学发光、荧光法或其他任何二级标记方法,直接利用质谱峰值定性定量测定。但是检测流程很复杂,包括PCR、PCR后处理(体外转录、RNase 剪切、条件处理)和MS数据收集图谱判读,对操作人员要求很高。
同其它DNA突变,多态性筛选方法,如焦磷酸测序,高效液相色谱、变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性等相比MALDi-TOF MS有很多优势。例如焦磷酸测序中插入/缺失不同碱基和未知突变时的不同相测序;超过5、6个相同碱基时的非线性光反应[32]。并且,焦磷酸测序虽然精确度高但却不是好的大规模、多通路检测工具[33]。高效液相色谱样品处理简单、自动化程度高、扫描精细,但是由于每个扩增子的的温度条件都需要单独设定所以很难标准化,而且不提供型别、位置等信息[34]。变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性只能给出分析片段是否存在变化的信息。
3. 核酸质谱技术应用
只观察个体中一定数量和种类的细胞,或是只观察一个个体或少数个体或小部分种群,都会给物种基因组信息带来偏差。近十年,MALDI-TOF MS因在高通量方面具有优势,在分子生物学应用领域得到快速发展。被广泛应用于SNP评价和等位基因频率分析、疾病易感基因、药物反应遗传标记发现,已知癌症相关体细胞基因突变检测等方面。并可用于病原体检测、分型,发现突变株,以及单倍型分析,发现基因突变,序列表较分析,基因表达定量分析、肿瘤基因甲基化分析、基因表达谱等方面研究。大量科研工作中使用了MALDI-TOF MS 方法。如基因分型方面,CYP2C9和VKORCI遗传型对华法林给药剂量影响[35],乙型病毒性肝炎耐药性基因突变检测[36],CYP2D6基因型与精神分裂关系[37],小麦SNP分型[38],JAK2V617F突变与骨髓增生紊乱[39]等;疾病易感性方面,克隆氏病(Crohn’s disease,CD)易感基因ATG16L1[40]、NLRP3区[41],炎性反应基因多态性与伤寒、副伤寒易感性研究[42],β2肾上腺素受体基因多态性与格雷夫病易感性研究[43],骨关节炎易感性等位基因鉴定[44];基因甲基化方面:TNF超家族同乳腺癌预后相关性研究[45],CASP8突变和乳腺癌风险相关性[46],遗传因素可控制人IGF2/H19基因甲基化突变研究[47],恶性胶质瘤超甲基化对RUNX3和TES的下行调节研究[48],慢性白血病中DAPK1的下行调节[49],PMEPA1基因甲基化在前列腺癌中的作用[50],ICAM基因为乳腺癌和前列腺癌的易感区[51]等。2007年Roman K Thomas等使用MassARRAY系统高通量检测1000份人肿瘤样本中的238个已知癌基因突变,建立起跨17种癌症类型的突变分布图[52]。
在临床应用方面,MALDI-TOF MS因其高分辨率(可用于混合样本或多位点检测)和高通量(阵列技术,Sequenom 384孔/板)适用于大样本筛查、多重病原体、遗传位点检测、病原体分型等应用。USA CDC分子流行病和生物信息实验室病毒性肝炎分部曾在多个项目中使用MassARRAY系统,如乙肝病毒、丙肝病毒快速分型,丙肝病毒及其相关突变体分析等。另外Sequenom针对癌基因突变检测特别推出OncoCarta Panel v1.0用于快速发现和确认包括EGFR、BRAT、KIT和KRAS等19个主要癌基因的体细胞突变(单碱基突变、碱基插入和缺失)。在HPV检测方面,2008年Söderlund Strand A等在Clinical Chemistry上发表文章使用MassARRAY系统高通量检测HPV高危型别(14个)[53],共检测532个宫颈癌细胞样品,质谱检测(hCM扩增)与RDBH(GP5+/GP6+)方法比较,文章中质谱比RDBH多检测出5个阳性样本,但是在混合型样本和样本分型方面两种方法的一致性很差,作者也没有给出具体光谱图形。同年Sun Pyo Hong 等在Nature protocol上发表使用MALDI-TOF MS 对HPV分型的方法性文章,文章指出该方法至少可以准确区分74的HPV型别。使用方法为限制性片段质量多态性(RFMP)质谱分析,引入TypeIIS限制性内切酶剪切制备不同质量片段[30]。而Söderlund是使用引物特异碱基延伸方法制备质量片段。
Sequenom公司推出MassARRAY系统(包括不同研究领域配套环境软件和商业化试剂)用于核酸分析,例如检测DNA甲基化的EpiTYPER™,包括预制EpiPanels,EpiBrowser(用户软件 工具);iPLEX® Gold assay,SNPs检测工具;iSEQ™比较序列分析工具等,为使用MALDI-TOF MS在核酸分析方面的学术研究和临床应用带来了极大的便利。
发布于 11/17/2009 10:23:29 | 评论:5

FISH——癌症 @ 8/24/2009

每一天
白血病——费城染色体——FISH检测       
cells positive for a chromosomal t(9;22) rearrangemen


一个间期,一个中期细胞
膀胱癌——FISH检测

发布于 8/24/2009 15:22:17 | 评论:1

宝宝 @ 8/17/2009

大事小情

百日

牛宝宝等公车
发布于 8/17/2009 21:45:22 | 评论:6