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MALDI-TOF MS核酸检测方法
随着人类基因组计划在2003年提前完成，后基因组计划的蓬勃发展，新技术不断涌现，更多的研究成果和新技术和仪器被应用于学科深层领域的研究和医学临床检测。精细定量，精确定位，大规模高通量，自动化，人性化的研究工具和操作系统受到广大科研工作者和临床检测人员的推崇和好评。核酸质谱技术结合了质谱技术的高灵敏、精确性，PCR的高敏感性和阵列技术的高通量，近几年在核酸的定性定量研究和应用中取得非常多的成绩。这里我们将从工作原理，科研、临床应用等方面为大家介绍基质辅助激光激光解析电离时间飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)核酸检测方法。
1. 基质辅助激光激光解析电离时间飞行时间质谱 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF MS) 工作原理
1986年Eugen Goldstein发现阴极射线和阳极射线；1899年Wilhelm Wien利用质量电荷比在电场和磁场分离阳极射线并发现质量电荷比同放电管中的气体属性相关，J.J. Thomson继Wien之后通过降低压力改良Wien的研究；1918年、1919年A. J. Dempster和F. W. Aston分别设计并建造了质谱仪，帮助物理学家通过元素质量鉴定样品化合物成分和同位素组成，奠定了现代质谱仪的基本理论和设计概念。1989年，Hans Dehmelt 和 Wolfgang Paul 因五六十年代发明了离子收集技术或诺贝尔物理奖；2002年，J. B. Fenn和K. Tanaka因在1987年分别发明电喷射离子化（electrospray ionization, ESI）和软激光解析（soft laser desorption, SLD）技术共同获得诺贝尔化学奖；而MALDI技术由Franz Hillenkamp和Michael Karas发明，并被广泛用于蛋白分析[1]。
1.1 质谱（Mass spectrometry， MS）技术原理
MS技术主要用于测定样品或分子的元素组成和分子化学结构，例如肽和其它化合物。原理主要是化合物离子化产生带电分子或分子片段，带点颗粒加速经过电磁场，被检测并根据其质量电荷比值[2]分类。质谱仪由3个模块构成：（1）离子源，用于样品气化、离子化。 离子化技术包括电子电离和化学电离。EI （electrospray ionization）和MALDI （matrix-assisted laser desorption/ionization）这两项技术常被用于生物液体和固体样本离子化。（2）质量分析器，提供电磁场通过质量电荷比值（m/z）分离离子。质量分析方法主要有：Sector，Time-of-flight (TOF)，Quadrupole，Quadrupole ion trap，Linear quadrupole ion trap，Fourier transform ion cyclotron resonace，Orbitrap和其它一些为特殊情况设计的质量分析器[3-9]。（3）检测器，记录离子经过或轰击表面产生的电荷或电流，计算离子丰度，检测器信号或经过增幅的信号经过扫描绘制成质谱。质谱技术可用于定量和定性检测。
1.2 基质辅助激光激光解析电离（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI）
MALDI是一项弱离子化技术，用于生物分子（如蛋白、肽、糖）和大有机分子（如聚合物）等在常规离子化条件下脆性过大分子的质谱分析，和电喷射离子化性质相似。离子化作用由激光触发，使用基质保护生物分子免受激光直接损伤，并帮助分子气化、离子化。EI和MALDI是核酸质谱分析常用的弱离子化技术[10,11]。
基质包括3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid、2,5-dihydroxybenzoic acid、3-hydroxypicolinic acid、α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid methyl ester）等添加TFA的水、有机溶剂混合液，合适的基质在满足基本条件后通过反复试验获得[12-16]。分析物的基质溶液点入MALDI板，溶剂挥发后，基质再和分析物再结晶，晶斑经激光照射获得能量离子化，转移部分电荷到分析物，使分析物离子化并降低激光的能量破坏。此时分析物构成由中性分子[M]和增加(如[M+H]+)、减少（如[M-H]-）的类分子离子。MALDI能够产生单电荷离子，但同时也会产生多电荷离子。
1.3 飞行时间质谱 （Time-of-flight MS， TOF MS）
TOFMS中用给定强度电场加速离子，使带相同电荷的离子动能相同，离子速度仅依赖于质量电荷的比值，测量带颗粒到达固定长度距离检测器的时间，飞行时间同质量电荷比值相关，质量小的颗粒先到达。根据测得的时间和已知的实验参数可以得出离子的质量电荷比。TOF MS中常使用下列技术提高离子分辨率，Delayed extraction, Reflectron TOF, Ion gating, Orthogonal acceleration TOF, Hadamard transform TOF, Tandem TOF/TOF[17-19]。
TOF MS 由于质量范围大而广泛的和MALDI联合使用，TOF测量步骤也因为脉冲激光独立发射而非连续操作而非常适用于MALDI离子化过程。MALDI-TOF质谱仪典型性的安装有“离子镜”，在电场中偏转离子，加倍离子飞行距离增加分辨率。现在商业化偏转 TOF设备的分辨率m/Δm 约为20’000FWHM（full-width half-maximum, Δm指50%峰高时的峰幅）。
2. MALDI-TOF MS核酸检测
MALDI-TOF MS分别在1995年和1998年作为核酸检测技术引入DNA[20]和RNA[21]分析。检测样品需被制成3-29bp（1,000-8,600 Dalton）的单链核酸，和基质混合。
1998年 Zhengdong Fei 等提出ddNTPs质量标记（引物单核苷酸延伸）方法制备质量样本使用MALDI-TOF MS 检测SNPs[22]，2002年 Rodi等提出使用UDG酶介导的碱基特异性剪切引入PCR产物片段结合MALDI-TOF MS的方法[23]。2003年Krebs 等提出基于RNA体外转录PCR（T3和T7-tailed引物）、rGTP特异性识别的RNase T1介导的碱基特异性剪切和MALDI-TOF MS 结合检测SNPs[24]。Hartmer 等提出加入T7、SP6 RNA启动子，RNAse T1，阵列技术的高通量质谱检测SNPs方法[25]。Stanssens等使用RNAse A（特异性剪切C或T碱基）和样品DNA双向转录方法，同时对序列中所有的4个碱基特异性剪切[26]，使结果更为准确。这种方法也被称为hMC-Assay，分别产生4个核苷酸的质量图谱。一般来说，T剪切反应比C剪切反应稳定[27]。同年Sebastian使用上诉双向转录，4碱基酶切方法检测100-1000bpPCR片段的SNPs和突变，并提出应用于未知和连续突变点的算法[28]。2005年，Mathias Ehrich等提出用MALDI-TOF MS结合碱基特异性剪切方法高通量鉴定甲基化位点，对一个或多个CpG位点半定量测定[29]。2008年Sun Pyo Hong 等使用TypeIIS限制性内切酶制备不同质量片段，构建限制性片段质量多态性（RFMP）质谱对HPV分型[30]。
样品不纯会严重影响分基质-析物纯的共结晶，进而影响质谱结果；另一方面，核酸磷酸股价带有负电荷和反应缓冲液中的Na+、K+作用严重影响质谱信号的强度和分辨率，所以必须对样品进行有效的纯化。液相色谱纯化耗时太长，成本太高；常用的乙醇沉淀、透析、凝胶过滤等方法，或是加入阳离子交换树脂替换碱性离子的方法无法有效去除反应缓冲液中的去污剂。2006年Sauer等提出化学修饰的方法使用磷酸酰基团替换磷酸基团，甲硫化产生带有一个正或负电荷的产物，然后依赖基质的解析，用于高通量候选基因SNP质谱分型中，也称为无需纯化检测（GOOD Assay）[31]。
MALDI-TOF MS可以分辨2-5da的质量差，单核苷酸改变产生9-40da的质量漂移，所以可以被MALDI-TOF MS轻易的检出。通常情况下hMC-MALDI-TOF MS可以检测500bp片段中98%的SNPs。实际上，因为质量图谱质量、片段质量超出检测范围或质量相同的几个片段造成沉默峰等原因，一些反应的结果无法判断。MALDI-TOF MS 核酸检测具有PCR技术的高敏感性，模板浓度要求低、质谱技术的高分辨率和阵列技术的高通量等特点，且无需化学发光、荧光法或其他任何二级标记方法，直接利用质谱峰值定性定量测定。但是检测流程很复杂，包括PCR、PCR后处理（体外转录、RNase 剪切、条件处理）和MS数据收集图谱判读，对操作人员要求很高。
同其它DNA突变，多态性筛选方法，如焦磷酸测序，高效液相色谱、变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性等相比MALDi-TOF MS有很多优势。例如焦磷酸测序中插入/缺失不同碱基和未知突变时的不同相测序；超过5、6个相同碱基时的非线性光反应[32]。并且，焦磷酸测序虽然精确度高但却不是好的大规模、多通路检测工具[33]。高效液相色谱样品处理简单、自动化程度高、扫描精细，但是由于每个扩增子的的温度条件都需要单独设定所以很难标准化，而且不提供型别、位置等信息[34]。变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性只能给出分析片段是否存在变化的信息。
3. 核酸质谱技术应用
只观察个体中一定数量和种类的细胞，或是只观察一个个体或少数个体或小部分种群，都会给物种基因组信息带来偏差。近十年，MALDI-TOF MS因在高通量方面具有优势，在分子生物学应用领域得到快速发展。被广泛应用于SNP评价和等位基因频率分析、疾病易感基因、药物反应遗传标记发现，已知癌症相关体细胞基因突变检测等方面。并可用于病原体检测、分型，发现突变株，以及单倍型分析，发现基因突变，序列表较分析，基因表达定量分析、肿瘤基因甲基化分析、基因表达谱等方面研究。大量科研工作中使用了MALDI-TOF MS 方法。如基因分型方面，CYP2C9和VKORCI遗传型对华法林给药剂量影响[35]，乙型病毒性肝炎耐药性基因突变检测[36]，CYP2D6基因型与精神分裂关系[37]，小麦SNP分型[38]，JAK2V617F突变与骨髓增生紊乱[39]等；疾病易感性方面，克隆氏病（Crohn’s disease,CD）易感基因ATG16L1[40]、NLRP3区[41]，炎性反应基因多态性与伤寒、副伤寒易感性研究[42]，β2肾上腺素受体基因多态性与格雷夫病易感性研究[43],骨关节炎易感性等位基因鉴定[44]；基因甲基化方面：TNF超家族同乳腺癌预后相关性研究[45]，CASP8突变和乳腺癌风险相关性[46]，遗传因素可控制人IGF2/H19基因甲基化突变研究[47]，恶性胶质瘤超甲基化对RUNX3和TES的下行调节研究[48]，慢性白血病中DAPK1的下行调节[49]，PMEPA1基因甲基化在前列腺癌中的作用[50]，ICAM基因为乳腺癌和前列腺癌的易感区[51]等。2007年Roman K Thomas等使用MassARRAY系统高通量检测1000份人肿瘤样本中的238个已知癌基因突变，建立起跨17种癌症类型的突变分布图[52]。
在临床应用方面，MALDI-TOF MS因其高分辨率（可用于混合样本或多位点检测）和高通量（阵列技术，Sequenom 384孔/板）适用于大样本筛查、多重病原体、遗传位点检测、病原体分型等应用。USA CDC分子流行病和生物信息实验室病毒性肝炎分部曾在多个项目中使用MassARRAY系统，如乙肝病毒、丙肝病毒快速分型，丙肝病毒及其相关突变体分析等。另外Sequenom针对癌基因突变检测特别推出OncoCarta Panel v1.0用于快速发现和确认包括EGFR、BRAT、KIT和KRAS等19个主要癌基因的体细胞突变（单碱基突变、碱基插入和缺失）。在HPV检测方面，2008年Söderlund Strand A等在Clinical Chemistry上发表文章使用MassARRAY系统高通量检测HPV高危型别（14个）[53]，共检测532个宫颈癌细胞样品，质谱检测（hCM扩增）与RDBH（GP5+/GP6+）方法比较，文章中质谱比RDBH多检测出5个阳性样本，但是在混合型样本和样本分型方面两种方法的一致性很差，作者也没有给出具体光谱图形。同年Sun Pyo Hong 等在Nature protocol上发表使用MALDI-TOF MS 对HPV分型的方法性文章，文章指出该方法至少可以准确区分74的HPV型别。使用方法为限制性片段质量多态性（RFMP）质谱分析，引入TypeIIS限制性内切酶剪切制备不同质量片段[30]。而Söderlund是使用引物特异碱基延伸方法制备质量片段。
Sequenom公司推出MassARRAY系统（包括不同研究领域配套环境软件和商业化试剂）用于核酸分析，例如检测DNA甲基化的EpiTYPER™，包括预制EpiPanels，EpiBrowser（用户软件 工具）；iPLEX® Gold assay，SNPs检测工具；iSEQ™比较序列分析工具等，为使用MALDI-TOF MS在核酸分析方面的学术研究和临床应用带来了极大的便利。